Viroidy a obelisky
Tí, ktorí profitujú z transparentnosti sekvencií, by sa mali pozrieť do zrkadla
Tento týždeň bola objavená nová biologická entita známa ako obelisk. Ide o veľmi dôležitý chýbajúci článok medzi viroidmi a vírusmi.
Stúpenci tohto Substacku vedia, že veľa času trávime štúdiom latentného viroidu chmeľu, ktorý infikuje rastlinu konope. Toto je vynikajúci príklad, ktorý roztápa mysle tábora "bez vírusov" a "PCR je zbytočná".
Prečo toľký rozruch?
Je ľahké chemicky syntetizovať čistý kruhový viroid RNA s iba 256 bázami, infikovať rastlinu a sledovať, ako sa výnos úrody prepadne o 40%. Pri ľahko klonovateľných rastlinách stačí vykonať PCR na prítomnosť viroidu, vyradiť pozitívne rastliny a byť svedkom zlepšenia úrody, ktoré ľahko pokryje náklady na PCR.
Tento viroid sa ľahko replikuje v hostiteľovi a prenáša sa mechanicky (klonovacími nožnicami alebo hmyzom) alebo peľom. Existujú určité špekulácie o prenose spór húb (Fusarium) a mycélia pri niektorých viroidoch. Táto oblasť je ešte len v začiatkoch, ale v každom prípade sú Kochove postuláty jednoznačné a viroidy sa považujú za evoluč-ných predkov vírusov.
Tábor "bez vírusov" nemá kam ustúpiť, keď sa preukáže, že môžete izolovať čistý viroid pomocou oligo syntetizátora a že je infekčný a spôsobuje prenosné ochorenie. Ľudia zo skupiny "žiadna pandémia" sú rovnako zmätení, pretože latentný viroid chmeľu bol zdokumentovaný v USA, Kanade, Číne, Nemecku, Brazílii a Izraeli napriek tomu, že sa neprenáša respiračným spôsobom. Má širšie spektrum hostiteľov, ako sa pôvodne uvádzalo (chmeľ, konope, žihľava, paradajka, aby sme vymenovali aspoň niektoré).
Viroidy boli zdokumentované len v rastlinách. Sú to kruhové RNA v tvare tyčiniek (vlásenky alebo komplementárne kruhy), ktoré nekódujú žiadne bielkoviny. Ich sekvenčnú rozmanitosť a schopnosť skladania sledujeme na stránke Viropedia.net.
Prirovnania genómov latentných viroidov chmeľu ku génom konope. COG7, EXLA1 a CLASP sú na viroidnom genóme farebne označené
Predpokladá sa, že ich mechanizmus účinku spočíva v downregulácii hostiteľských mRNA, ktoré majú s viroidom spoločnú krátku (19–25bp) sekvenčnú homológiu. Ide o proces známy ako RNA interferencia (RNAi), za ktorý Andrew Fire a ďalší získali Nobe-lovu cenu.
Dôvodom na sledovanie variantov v genóme viroidu je, že občas SNP viroidu alebo SNP konope indukuje sekvenčnú homológiu medzi inými génmi hostiteľa, ako je napríklad kalóza syntáza. Tento gén kóduje proteín, ktorý upcháva otvory v plazmo-desmách bunkových stien rastlín. Znížením regulácie mRNA pre tento gén sa bunky stanú netesnými a viroid sa môže šíriť z bunky na bunku cez póry plazmodesmat.
Ten istý autor, ktorý objavil RNAi, teraz objavil obelisky a môže to byť rovnako dôležitý objav. Je dôležité si uvedomiť, že to objavili bez toho, aby zdvihli jedinú pipetu. Jedno-ducho mali hypotézu a išli ju hľadať do obrovského množstva verejných údajov RNA-Seq v NCBI SRA. Ukazuje to, aké dôležité je odraziť svoju hypotézu od existujúcich údajov vo verejnej sfére. Mnohí ľudia z tábora "bez pandémie" to pravidelne nerobia a prichádzajú s rôznymi bláznivými hypotézami, ktoré sa dajú ľahko falzifikovať vyhľada-ním týchto údajov, aby ste zistili, či vaša hypotéza stále platí.
Tu je príklad vynikajúceho vlákna, ktoré vyvracia mnohé z No-Pandemic Noise, ktoré v poslednom čase vychádza z PANDA. Je to dlhé vlákno, pretože existuje nekonečný šum, ktorý sa dá vygenerovať, keď ste príliš leniví na to, aby ste surfovali po týchto údajoch a hľadali zhodu alebo nulovanie.
Čo sú teda obelisky a ako zapadajú vedľa viroidov a vírusov. Viroidy nekódujú žiadne peptidy. Len vytvárajú hromady RNA, keď sa dostanú do bunky, pretože kruhové RNA sa zosilňujú do mimoriadnej miery vďaka procesu známemu ako Rolling circle ampli-fication*. Keďže RNA je kruhová, polymerázy vytvárajú dlhé konkatery jednovláknovej RNA podobne, ako rybársky navijak dokáže natočiť dlhé šnúry.
*"Rolling circle amplification" (RCA) je technika používaná v molekulárnej biológii na ampli-fikáciu (zväčšenie) jednovláknových molekúl DNA alebo RNA. V tomto kontexte, technika "Rolling circle amplification" znamená, že cirkulárne RNA (kruhové formy RNA molekúl) sa zväčšujú na mimoriadne vysoké úrovne v bunke. Tento proces umožňuje rýchlu a účinnú amplifikáciu cirkulárnej RNA a vytvára veľké množstvo RNA v bunke.
Viroidní kolonisti ľudských mikrobiómov. Abstrakt: V tejto práci opisujeme "obelisky", doteraz nerozpoznanú triedu viroidom podobných prvkov, ktoré sme prvýkrát identifikovali v meta-transkriptomických údajoch z ľudských čriev. "Obelisky" majú niekoľko spoločných vlastností: (i) zjavne kruhové zostavy genómu RNA cca 1kb, (ii) predpokladané tyčinkovité sekundárne štruk-túry zahŕňajúce celý genóm a (iii) otvorené čítacie rámce kódujúce novú proteínovú nadrodinu, ktorú nazývame "Oblins". Zistili sme, že Oblins tvoria vlastnú odlišnú fylogenetickú skupinu bez zistiteľnej sekvenčnej alebo štrukturálnej podobnosti so známymi biologickými činiteľmi. Obe-lisky sa ďalej vyskytujú v testovaných metatransskriptómoch ľudského mikrobiómu, pričom ich zástupcovia boli zistení v cca 7% analyzovaných metatransskriptómoch stolice (29/440) a v zhruba 50% analyzovaných metatransskriptómoch ústnej dutiny (17/32). Zdá sa, že zloženie obeliskov sa v jednotlivých anatomických lokalitách líši a je schopné pretrvávať u jedincov, pričom v jednom prípade bola pozorovaná pretrvávajúca prítomnosť počas >300 dní. Pri rozsiah-lom vyhľadávaní sa identifikovalo 29,959 obeliskov (zoskupených pri 90% identite nukleotidov) s príkladmi zo všetkých siedmich kontinentov a v rôznych ekologických nikách. Na základe tohto vyhľadávania sa identifikovala podskupina Obeliskov, ktoré kódujú pre Obelisky špecifické varianty samoštiepiaceho sa ribozýmu typu kladivo-lll. Napokon sme identifikovali jeden prípad bakteriálneho druhu (Streptococcus sanguinis), v ktorom podmnožina definovaných laboratór-nych kmeňov ukrývala špecifickú populáciu Obelisk RNA. Obelisky ako také tvoria triedu rôzno-rodých RNA, ktoré kolonizovali a zostali nepovšimnuté v ľudských a globálnych mikrobiómoch.
Bunka potom tieto konkateméry spracúva, ale rozreže ich na kúsky a znovu ich zakrúžkuje. Pri takomto množstve RNA v bunke sa akákoľvek iná hostiteľská mRNA, ktorá má s viroidnou RNA spoločné krátke sekvencie, zníži v procese známom ako RNA interferencia (tiež prvýkrát opísaná Fireom a kol.).
Niektoré požiadavky na viroidy:
Žiadny ORF
Kruhová RNA
Tyčinkovitý tvar alebo vlásenky. Teda samokomplementárna
Zvyčajne dĺžka 256–500 báz
Na druhej strane, vírusy kódujú proteíny. Nemusia byť nevyhnutne kruhové, ani krátke alebo vlásočnicové. Vírusy majú zvyčajne kódovanú polymerázu (RdRp), ktorá pomáha pri replikácii.
Viroidy majú často aktivitu ribozýmu, ktorý pomáha rozsekávať konkatery na 256bp kúsky na ďalšiu cirkularizáciu. Ribozýmy sú RNA, ktoré sa skladajú do molekúl, ktoré sa správajú ako katalytické enzýmy.
Obidve sú v strede. Sú to cirkulárne RNA, tyčinkovité, zvyčajne pod 1,200bp ALE obsahujú krátke otvorené čítacie rámce a niekedy ribozýmy. V tomto prípade sa nazývajú Oblin-ové ORF.
Je to dôležité zistenie, pretože vypĺňa dieru v biológii, ktorej existencia sa očakávala, ale nikdy sa nenašla, kým sa agresívne nehľadala. Ľahko sa prehliadajú, pretože krátkočítacie assemblery (150bp čítania) sa často mýlia s tandemovými opakovaniami, ktoré sú dlhšie ako dĺžka čítania sekvenátora.
V rámci boja proti tomu sa autori zamerali na vyhľadávanie RNA-Seq vo verejnej sfére, ktorá využívala reťazovú RNA-Seq. Tým sa zachováva viac informácií o pôvode vlákien RNA, takže sa ľahšie zisťujú a rozpletajú samokomplementárne RNA. Kruhovitosť RNA tiež zamotáva hlavu zostavovateľom, pretože sa snažia vytvoriť dlhé lineárne chromo-zómy a nie sú naučení myslieť na RNA, ktorá je kruhová.
V dôsledku toho majú tieto štrukturálne RNA iný selektívny tlak ako len nesynonymné a synonymné mutácie. Musia si zachovať štruktúru rodu, inak sa naruší časť ribozýmo-vej aktivity RNA. Často si musia zachovať kvadruplexové G, takže typická kodónová analýza nepomáha predpovedať selektívny tlak.
Predpokladá sa, že tieto Obelisky sa replikujú v baktériách v ústnych mikrobiómoch ľudí. Viac ako 50% mikrobiómov ústnej dutiny zdravých ľudí malo Obelisky.
Článok ponecháva v diskusii mnoho zaujímavých otázok, pokiaľ ide o to, čo tieto Obelisky robia. Majú nejaký klinický význam? Ako sa replikujú, ak ich nemožno nájsť v archívoch sekvenovania DNA? Ako sa prenášajú? Aká je funkcia proteínu Oblin. Prečo homológia ribozýmu s kladivkovou hlavou?
Jedno je jasné, tyčinkovité RNA sú neuveriteľne robustné. U niektorých pacientov našli Obelisky prítomné viac ako 300 dní. Je to očakávané, keďže ich evoluční predkovia (viroidy) majú tiež tvar tyčiniek a sú odolné voči plameňom.
O odolnosti voči plameňom a RNA sa často nepočuje. Každý laborant sa trápi nad tým, aká je mRNA jemná, ale táto jemnosť je v skutočnosti len odrazom všadeprí-tomných RNáz, ktoré majú laboranti na rukách.
Viroidy dokážu prežiť propánové horáky po dobu 4-6 sekúnd a na ich odstránenie je potrebné bielidlo alebo RNázaIII. Obelisky pravdepodobne zdieľajú tieto vlastnosti.
To ma priviedlo k zaujímavému veľkonočnému vajíčku v dokumente o Obelisku.
Ukazuje sa, že odborníci na mRNA vakcíny sa snažia využiť túto tyčinkovitú štruktúru RNA pri optimalizácii kodónov, aby zlepšili životnosť modRNA u ľudí.
Zaznamenali sme to už v roku 2021, keď sme do RNAFold vložili mRNA vakcíny.
Kým sme si všimli obohatenie GC a obohatenie Quadruplex G vo vakcínach, celkom som nedocenil, že tyčinkové formy, ktoré dodávajú, sú zámerné.
Zhang a kol. vysvetľujú, ako to urobiť.
Algoritmus pre optimalizovaný návrh mRNA zlepšuje stabilitu a imunogénnosť. Abstrakt: Vakcíny s messengerovou RNA (mRNA) sa používajú na boj proti šíreniu COVIDu-19 (ref.), ale stále vykazujú kritické obmedzenia spôsobené nestabilitou a degradáciou mRNA, ktoré sú hlavnými prekážkami pre skladovanie, distribúciu a emicitu vakcínových produktov. Zvýšenie sekundárnej štruktúry predlžuje polčas rozpadu mRNA, čo spolu s optimálnymi kodónmi zlepšuje expresiu proteínov. Principiálny algoritmus návrhu mRNA preto musí optimalizovať štrukturálnu stabilitu aj použitie kodónov. Vzhľadom na synonymné kodóny je však priestor pre návrh mRNA neúnosne veľký – napríklad pre spike proteín SARS-CoV-2 existuje približne 2,4x10,632 kandidátskych sek-vencií mRNA. To predstavuje neprekonateľnú výpočtovú výzvu. V tejto práci ponúkame jednodu-ché a neočakávané riešenie pomocou klasického konceptu rozboru mriežky v počítačovej ling-vistike, kde nájdenie optimálnej sekvencie mRNA je analogické s identifikáciou najpravdepodob-nejšej vety spomedzi podobne znejúcich alternatív. Náš algoritmus LinearDesign nájde optimálny návrh mRNA pre proteín spike len za 11 minút a dokáže súčasne optimalizovať stabilitu a použi-tie kodónov. LinearDesign podstatne zlepšuje polčas rozpadu mRNA a expresiu proteínu a hlboko zvyšuje titer protilátok až 128-krát u myší v porovnaní s referenčnou hodnotou optimalizácie kodónov na mRNA vakcíny pre COVlD-19 a varicella-zoster vírus. Tento výsledok odhaľuje veľký potenciál principiálneho návrhu mRNA a umožňuje skúmať predtým nedosiahnuteľné, ale vysoko stabilné a emcientné návrhy. Naša práca je aktuálnym nástrojom pre vakcíny a iné lieky na báze mRNA kódujúce terapeutické proteíny, ako sú monoklonálne protilátky a protirakovinové lieky.
Opäť tu máme molekulárnych biológov posadnutých týmto myslením, že dlhšie trvanie musí byť lepšie.
Ooops.
To je ďalší dôvod, prečo sa modRNA zisťujú mesiace po očkovaní napriek tomu, že sa hovorí, že by sa mali odstrániť do 48 hodín.
Ide o úžasný objav, ktorý je rovnako významný ako objav lincRNA. Mal som to poteše-nie publikovať s Andrewom Fireom pomocou sekvenátora SOLiD. Bola to jedna z prvých publikácií s použitím sekvenátora SOLiD a v roku 2008 sa dostala na titulnú stranu časopisu Genome Research.
Napriek všetkým úspechom Fireových laboratórií mám jednu kritiku. Tento objav je ukážkovým príkladom dôležitosti predkladania nespracovaných čítaní z vašich sekvenačných projektov do SRA. To umožňuje objavy, ako je tento, ktoré nie sú zjavné, kým sa nedajú vyťažiť údaje z rôznych projektov, ktoré nie sú zamerané na tieto zaujímavé otázky post hoc.
Možno poznáte meno laboratórií Fire z čias, keď sekvenovali vakcíny a napriek častým žiadostiam nezverejnili takéto sekvencie surových čítaní. Keby ich boli zverejnili, kontaminácia DNA plazmidov vakcín by bola známa o 2–3 roky skôr!
Toto nie je normálne. Väčšina genómových projektov a časopisov vyžaduje zverejnenie surových čítaní práve z tohto dôvodu. Ďalší výskumníci tieto údaje dolujú a nachá-dzajú v nich množstvo diamantov, ktoré môžu zmeniť závery. Steve Massey a Steve Quay našli vo vnútri týchto archívov SRA rôzne zaujímavé detaily, ktoré informovali o pôvode vírusu C19.
Tieto žiadosti o surové čítania som opakoval aj po zverejnení plazmidovej kontami-nácie. Stále žiadna odpoveď. Je to veľmi podozrivé. Naznačuje to, že ich čítania majú dôkazy o plazmidoch a nechcú, aby sa svet dozvedel, že tieto údaje pochovali v mene prevencie "váhania s vakcínou".
Práve tento paternalizmus bielych laboratórnych plášťov infikuje mysle, ktoré ospra-vedlňujú "Nobelovu lož". Musíme zachrániť plebs pred ním samým a skrývať údaje. Nezvládnu pravdu a vytvárajú dezinformácie, zatiaľ čo zámerne ignorujú realitu a zavádzajú sami seba.
Práve toto pohŕdanie slonovinovej veže ohľadne verejného intelektu vždy vedie k väčšiemu autoritárstvu a politickej centralizácii moci. Keďže verejnosti nemožno dôverovať, pokiaľ ide o pravdu, potrebujeme vládu, ktorá jej nariadi to, čo vieme, že je pre ňu najlepšie.
Predpokladám, že ich laboratórium bude bagatelizovať význam plazmidovej DNA ako príliš krátkej na to, aby na nej záležalo. Bude to zaujímavé vzhľadom na to, že ich práca sa v súčasnosti zameriava na funkčnosť krátkych sekvencií, ako sú viroidy a obelisky.
To by malo byť pripomienkou, že kodónová optimalizácia je nesprávny názov. Naše súčasné chápanie zložitosti biológie necháva len tých, ktorým chýba pokora, aby ju takto pomenovali. Nádej v kodónovú optimalizáciu je oveľa vhodnejšia vzhľadom na to, že zmeny v sekundárnej štruktúre RNA môžu mať taký veľký vplyv na spracovanie RNA a interferenciu RNA. Túžba zaviesť novú platformu kvôli stroju na peniaze bez zodpovednosti priviedla Ikara k slnku, tak ako moľa k plameňu.