Test Med Gen qPCR na hodnotenie kontaminácie DNA Pfizer a Moderna
Anandamide, 18. marca 2023
Tieto sady primerov qPCR boli skrínované na vakcínach Pfizer, Moderna a Janssen. Spike test je pozitívny na všetky 3 vakcíny. Primery Vector Origin amplifikujú rovnako vakcíny Pfizer a Moderna, ale pri vakcíne Janssen (odlišný adenovírusový vektor) majú oneskorenie ~10CT.
Pozície qPCR primerov na vektore Pfizers vo fialovej farbe
Sady primerov pre qPCR mRNA vakcín uvedené nižšie.
Medicinal Genomics má komerčne dostupné súpravy na qPCR, RT-qPCR a extrakciu DNA/RNA. Tieto boli použité pri miliónoch testov v kanabisovom priemysle. Pre jednoduchšie objednávanie a jednoduché používanie dodávame tieto súpravy primerov qPCR špecifických pre vakcíny, ale zatiaľ nie sú na našej webovej lokalite. Ďalšie informácie o ich dostupnosti získate na adrese Info@medicinalgenomics.com.
Spike test
MedGen-Moderna_Pfizer_Janssen_Vax-Spike_Forward
>AGATGGCCTACCGGTTCA
MedGen-Moderna_Pfizer_Janssen_Vax-Spike_Reverse
>TCAGGCTGTCCTGGATCTT
MedGen-Moderna_Pfizer_Janssen_Vax-Spike_Probe
>/56-FAM/CGAGAACCA/ZEN/GAAGCTGATCGCCAA/3IABkFQ/
Test pôvodu vektora
MedGen_Vax-vector_Ori_Forward
>CTACATACCTCGCTCTGCTAATC
MedGen_Vax-vector_Ori_Reverse
GCGCCTTATCCGGTAACTATC
MedGen_Vax-vector_Ori_Probe
/5HEX/AAGACACGA/ZEN/CTTATCGCCACTGGC/3IABkFQ/
Elúcia primeru na 100uM podľa pokynov IDT.
Pripravte 50x zmes primera a sondy.
25ul 100uM Forward Primer
25ul 100uM reverzný primer
12,5ul 100uM sonda
37,5ul ddH20 bez nukleáz.
Použite 15ul tejto zmesi v základnej zmesi qPCR, ako je uvedené nižšie. (0,5ul primeru/sondy na reakciu)
Použite 10ul tejto zmesi v nastavení hlavnej zmesi RT-qPCR, ktoré je uvedené nižšie.
Použité súpravy Medicinal Genomics Master Mix
https://store.medicinalgenomics.com/qPCR-Master-Kit-v3-200-rxns
https://store.medicinalgenomics.com/pathoseek-rt-qpcr-master-kit
Nastavenie reakcie pre 30 reakcií qPCR
114ul enzýmovej zmesi (zelená skúmavka)
24ul reakčného pufru (modrá skúmavka)
246ul bez nukleázy ddH20
15ul sady Primer-Probe Spike
15ul sady Primer-Probe Ori
Použite 13,8ul vyššie uvedenej MasterMix a 5ul prečistenej vzorky (1ul Vax DNA/RNA + 4ul ddH20, ak CT <15)
Nastavenie reakcie pre 34 reakcií RT-qPCR
200ul zmesi enzýmov
96ul bez nukleáz ddH20
20ul inhibítora RNázy (fialová skúmavka)
4ul DTT (zelená skúmavka)
10ul Súprava primerov a sond Spike
10ul Súprava primerov a sond Ori
10ul MasterMix a 1ul Vax DNA/RNA
Použitá súprava na čistenie DNA Medicinal Genomics MIP
https://store.medicinalgenomics.com/SenSATIVAx-DNA-Extraction-Kit-200-reactions_2
Metódy izolácie DNA/RNA založené na CTAB/Chloroforme/SPRI sú opísané v predchádzajúcich príspevkoch. Budete si musieť zabezpečiť vlastný chloroform a etanol.
Podmienky cyklovania
Tieto podmienky fungujú pre qPCR aj RT-qPCR. Poznámka: Pri qPCR je možné vynechať krok RT 50C. Vyššie uvedené súpravy MGC qPCR MasterMix majú enzým horúci štart, ktorý nie je ovplyvnený týmto krokom 50C. Kvôli kontrole porovnania RNA s DNA sme testy qPCR a RT-qPCR umiestnili na tú istú platňu a pre všetky vzorky spustili nižšie uvedený program so zahrnutým krokom RT. Zaznamenali sme, že účinnosť (strmší sklon krivky PCR) sady primerov Spike RT-qPCR sa zlepšuje pri 1-minútovom predlžovaní, ale v predchádzajúcich publikovaných prácach sa používali nižšie uvedené podmienky cyklovania s 30 sekundovým predlžovaním.
Podmienky cyklovania použité pre qPCR a RT-qPCR
Sekvencie amplikonov pre pozitívne kontroly. Kontaktujte info@medicinalgenomics alebo si objednajte IDT gBlocks.
Ori target
Spike target
Ak máte ďalšie požiadavky na technické informácie – Kevin.McKernan at medicinalgenomics.com